ATP 生物發(fā)光技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

尹子波1，侯玉柱1，2，尹建軍1，2，*，宋全厚1，2

（1．中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；2．國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100027）

摘要：ATP（三磷酸腺苷）生物發(fā)光法作為一種不斷完善成熟的微生物快速檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)該方法的歷史發(fā)展、檢測(cè)原理、目標(biāo)物提取方法、應(yīng)用領(lǐng)域和*新研究成果等做重點(diǎn)介紹，并對(duì)ATP 生物發(fā)光法的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展方向進(jìn)行總結(jié)和展望。

關(guān)鍵詞：ATP 生物發(fā)光法；熒光素—熒光素酶；**磁分離技術(shù)（IMS）；生物**納米磁微粒（BMNPs）

     微生物污染嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身體健康與生命**，目前國(guó)際上檢測(cè)微生物的標(biāo)準(zhǔn)方法是營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)法（PCA），但PCA 法需37 ℃下培養(yǎng)48 h，操作繁瑣，不能做到快速檢測(cè)。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外開(kāi)始廣泛的研究與應(yīng)用各種微生物快速檢測(cè)技術(shù)，如**學(xué)方法（ELISA[1-2）] 、電阻抗測(cè)量法[3]、快速紙片法[4]、核酸法[5]、微菌落技術(shù)[6]等。ATP 生物發(fā)光法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，適合對(duì)微生物污染進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，符合食

品加工企業(yè)的需求。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)該方法進(jìn)行了大量的研究與應(yīng)用。ATP 生物發(fā)光技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

1 ATP 生物發(fā)光法的發(fā)展歷史、原理及檢測(cè)步驟

1.1 ATP 生物發(fā)光法的發(fā)展歷史

ATP 的生物發(fā)光機(jī)理*早在1949 年由McEIroy和Strehler 提出[7]。1983 年，James D. Moyer 和J. FrankHenderson[8]提出細(xì)胞內(nèi)源性ATP的含量可以反映細(xì)胞的活性和活細(xì)胞的數(shù)量。1985 年，de Wet，J . R 等[9]**克隆了北美熒火蟲(chóng)（P. Pyralis） 的螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase）基因，并在大腸桿菌（E.coli）中表達(dá)，從中得到具有活性的蟲(chóng)熒光素酶。該酶分子量為62 ku，與熒光素反應(yīng)能夠產(chǎn)生波長(zhǎng)為560 nm 的熒光。20 世

紀(jì)80 年代，英國(guó)人首先研制出ATP 檢測(cè)儀，隨后發(fā)展到歐洲、美國(guó)和日本。2002 年，我國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)了食品加工企業(yè)HACCP （Hazard Analysis and Critical Control Point）實(shí)施指南，鼓勵(lì)食品企業(yè)引入ATP 生物發(fā)光快速檢測(cè)系統(tǒng)。目前，在餐飲服務(wù)食品**現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)設(shè)備配備基本標(biāo)準(zhǔn)中，ATP 生物發(fā)光快速檢測(cè)系統(tǒng)被應(yīng)用于環(huán)境潔凈度的評(píng)估檢測(cè)。

1.2 生物發(fā)光法的原理

ATP 生物發(fā)光法的原理就是在熒光素酶E（luciferase）和Mg2＋的作用下，熒光素LH2 （ luciferin）與ATP發(fā)生腺苷?；换罨罨蟮臒晒馑嘏c熒光素酶相結(jié)合，形成了熒光素—AMP 復(fù)合體，并放出焦磷酸（PPi）。該復(fù)合體被分子氧氧化，形成激發(fā)態(tài)復(fù)合物P*-E·AMP，放出CO2，當(dāng)該復(fù)合物從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)射光。并*終形成氧化蟲(chóng)熒光素P 和AMP[10]。反應(yīng)過(guò)程如下：

E+LH2+ATP E·LH2-AMP+PPi （1）

E·LH2-AMP+O2 [P*-E·AMP]+CO2 （2）

E-P+hv+AMP （3）

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，熒光素酶為非典型的Michaelis-Menten 氏酶[11]，*適pH 為7.5，對(duì)其作用底物之一—ATP 的酶促動(dòng)力學(xué)曲線呈S 型。在適當(dāng)?shù)偷腁TP 濃度范圍內(nèi)，其反應(yīng)的速度與ATP 濃度成**反應(yīng)的關(guān)系，即檢測(cè)的熒光值強(qiáng)度與ATP 濃度成一定比例關(guān)系。對(duì)于一定生理時(shí)期內(nèi)的活體微生物，均有較恒定水平ATP 含量，使得ATP 濃度與活體微生物含量之間

有較好的線性關(guān)系。而且微生物死亡后，其體內(nèi)的ATP 會(huì)很快被胞內(nèi)酶所降解，不會(huì)對(duì)活體微生物的測(cè)定產(chǎn)生影響。ATP 這些特點(diǎn)，使ATP 生物發(fā)光法成為較好的活體微生物的檢測(cè)方法。

1.3 檢測(cè)步驟

ATP 生物發(fā)光法檢測(cè)微生物的一般步驟：預(yù)先制作樣品微生物含量與ATP 生物發(fā)光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后取樣、提取ATP、加入酶反應(yīng)試劑、測(cè)定樣品微生物ATP發(fā)光值、*后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品中微生物實(shí)際數(shù)值。

2 ATP 生物發(fā)光法優(yōu)缺點(diǎn)

ATP 生物發(fā)光法檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)主要是快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高。從20 世紀(jì)80 年代以來(lái)，該方法的檢測(cè)限由10-14 mol 提高到了10-18 mol[12]，每次檢測(cè)微生物ATP的時(shí)間可以控制在幾分鐘之內(nèi)，是目前檢測(cè)微生物數(shù)目*快捷的方法。其缺點(diǎn)是不能區(qū)分微生物與非微生物ATP，不能特異性地區(qū)分微生物的種類(lèi)，并且樣品本身和ATP提取劑等含有的某些離子會(huì)對(duì)ATP的測(cè)定造成干擾和抑制發(fā)光作用，其靈敏度仍不能滿足某些樣品的直接檢測(cè)要求，如飲用水中菌落總數(shù)不能超過(guò)100 cfu/mL，而目前直接檢測(cè)限為1 000 cfu/mL[13]。

3 微生物ATP 提取方法的研究

ATP 生物發(fā)光法的關(guān)鍵步驟是如何提取胞內(nèi)ATP。目前，針對(duì)ATP 提取方法的研究有很多，主要有加熱裂解、超聲、酸、有機(jī)提取劑方法等?？紤]到提取方法的簡(jiǎn)便與實(shí)用性，ATP 提取劑是*為常用的一種方法，對(duì)于一種好的提取劑而言，首先要保證能夠快速提取細(xì)菌ATP 并且不會(huì)降解細(xì)菌ATP，其次對(duì)后續(xù)的ATP 檢測(cè)系統(tǒng)干擾*小或無(wú)干擾。舒柏華，趙志耀等[14]過(guò)對(duì)超聲、加熱超聲、加熱、三***（TCA）、氯仿等5 種萃取方法進(jìn)行的比較，結(jié)果顯示：超聲加熱方法*佳, 加熱法次之。它們對(duì)微生物ATP 分析抑制較小，且ATP 萃取率高，但需附加設(shè)備，操作繁瑣，難于推廣。伍季、朱海華等[15]研究了季胺鹽類(lèi)表面活性劑提取細(xì)菌ATP 方法，并將該法與傳統(tǒng)TCA 方法的提取效果做了比較，他們選擇了幾種裂解效果較好的表面活性劑苯扎氯銨（BAC）、苯扎溴銨（BAB）、雙癸基二甲基溴化銨（DDAB）、雙十烷基二甲基氯化銨（DDAC）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等作為ATP 提取劑的主要成分進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，優(yōu)化提取條件，并將傳統(tǒng)的TCA 法與這些方法的ATP 提取效果進(jìn)行了對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用苯扎氯銨提取細(xì)菌ATP 優(yōu)于TCA 和其他表面活性劑方法。然而，提取劑中的表面活性劑或多或少都會(huì)干擾熒光素—熒光素酶系統(tǒng)，造成微生物ATP 檢測(cè)值的降低，從而降低靈敏度。Lundin. Arne 和Anson. John George[16]研究采用惰性中和劑與ATP 提取劑相結(jié)合的方法，從而有效降低或消除提取劑對(duì)酶活性的抑制作用。該方法操作簡(jiǎn)單、迅速。其原理主要是利用環(huán)糊精的特殊結(jié)構(gòu)—6～8 個(gè)葡萄糖分子組成環(huán)形結(jié)構(gòu)，內(nèi)部疏水基團(tuán)可與表面活性劑的疏水尾部牢固結(jié)合，外部親水基團(tuán)對(duì)酶活性無(wú)抑制作用，從而達(dá)到使表面活性劑與酶分離的目的，降低或消除表面活性劑對(duì)酶活性的抑制作用。Nae-Cherng Yang 和Wai－Meng，Ho[17]等比較了高氯酸（HClO4）、硼酸緩沖液加熱、去離子水（DW）加熱等提取方法對(duì)細(xì)胞ATP 檢測(cè)的影響。實(shí)驗(yàn)表明，HClO4、磷酸緩沖鹽（PBS）、三羥甲基硼酸緩沖液（Trisborate

buffer）、一種溶菌緩沖液（lysis buffer）均對(duì)發(fā)光值有較大的抑制作用，而DW（煮沸的去離子水）法發(fā)光值*高，能使ATP 水解酶變性失活，同時(shí)對(duì)細(xì)胞ATP 有很好的提取效果。與其他方法相比有簡(jiǎn)單、迅速、高效的優(yōu)點(diǎn)，如HClO4 方法需中和，PBS 方法需進(jìn)一步的加熱條件。但該方法僅局限于細(xì)胞ATP 的提取。

4 應(yīng)用

4.1 在水中微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

由于水的基質(zhì)比較簡(jiǎn)單，同時(shí)對(duì)酶的活性影響比較小，所以目前該方法檢測(cè)水中微生物的應(yīng)用*為廣泛。吳慧清、李程思等[18]利用ATP 生物發(fā)光法檢測(cè)飲用水中的微生物含量。他們采用微濾膜技術(shù)過(guò)濾富集水中的微生物，然后加入緩沖劑和發(fā)光劑檢測(cè)熒光值，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)比較，孔徑為0.22 μL 和0.45 μL 的膜截留細(xì)菌率相差不大，但0.45 μL 膜過(guò)濾速度遠(yuǎn)快于0.22 μL膜。因此建議采用0.45 μL 孔徑的膜。該方法操作簡(jiǎn)單，成本低，檢測(cè)結(jié)果能夠成功反映出水中微生物總數(shù)。

4.2 在乳品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

李春艷、霍貴成等[19]研究了ATP 生物發(fā)光法在生牛乳中微生物檢測(cè)的應(yīng)用，他們首先將生乳用PBS 緩沖液稀釋20 倍，取50 μL 加入滴體細(xì)胞裂解劑混勻并過(guò)濾，然后膜上加入2 滴細(xì)菌裂解劑，再加入50 μL 酶反應(yīng)試劑，用槍反復(fù)吹吸3 次后測(cè)熒光值。實(shí)驗(yàn)表明，

ATP 生物發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)及平板計(jì)數(shù)法結(jié)果之間有良好的線性關(guān)系（r=0.948 5），相關(guān)程度為顯著相關(guān)（p<0.001）。

4.3 在肉類(lèi)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

舒伯華、孫丹陵等[20]研究了ATP 生物發(fā)光法在肉類(lèi)食品中微生物檢測(cè)的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生肉類(lèi)食品由于體細(xì)胞ATP 對(duì)結(jié)果的干擾較大，因此需要**掉樣品中體細(xì)胞ATP，其采用的方法是首先用0.2 %的TritonX-100 和0.15 %的apyrase 混合液**體細(xì)胞ATP，然后加入3 %的三***混合并振搖1 min，離心后取上清檢測(cè)ATP，該光值即為細(xì)菌ATP 發(fā)光值，整個(gè)過(guò)程需15 min。而熟肉類(lèi)中非細(xì)菌ATP 含量低，對(duì)結(jié)果影響較小可以省略**體細(xì)胞ATP 步驟而直接測(cè)定，整個(gè)過(guò)程需4 min。經(jīng)過(guò)38 份樣品實(shí)驗(yàn)對(duì)比，ATP 生物發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌菌落平板計(jì)數(shù)方法之間具有良好的線性關(guān)系（r=0.98）。

4.4 在物體表面微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

曹利蓉、張偉等[21]研究了ATP 生物發(fā)光法在餐具表面微生物污染檢測(cè)方面的應(yīng)用，他們首先在選定測(cè)試區(qū)域內(nèi)，滴加2 滴ATP 釋放液，用無(wú)菌棉拭子均勻涂抹測(cè)試樣品，采樣面積為100 cm2；然后在棉拭子頭部滴加6 滴ATP 釋放液，提取ATP；*后立即將拭子頭部ATP 提取液點(diǎn)在檢測(cè)膜上，用ATP 熒光儀測(cè)定生物發(fā)光值（RLU），同時(shí)采用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)大腸菌群和細(xì)

菌總數(shù)。其中規(guī)定大腸菌群陽(yáng)性為不合格，細(xì)菌總數(shù)以大于500 cfu/100 cm2 為不合格，ATP 生物發(fā)光法以RLU 大于600 為不合格。在282 份樣品中，3 種檢驗(yàn)方法所測(cè)出不合格樣本的陽(yáng)性率分別為23.4 ％，25.5 ％，9.4 ％。ATP 生物發(fā)光法的陽(yáng)性率與大腸菌群和細(xì)菌總數(shù)的陽(yáng)性率沒(méi)有顯著性差異（P＞0．05）。

4.5 在啤酒中的應(yīng)用

伍季、王燕等[22]研究了ATP 生物發(fā)光法快速檢測(cè)啤酒中的微生物技術(shù)。他們采用0.45 μL 濾膜真空過(guò)濾1 L 啤酒，將過(guò)濾后的濾膜置于無(wú)菌的試管中，然后加入250 μL 0.2 mol/L Tris—乙酸和250 μL ATP 抽提劑，抽提60 s，抽提完成后，取100 μL 溶液與100 μL

熒光素—熒光素酶溶液混合均勻，檢測(cè)發(fā)光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，啤酒中菌落總數(shù)與生物發(fā)光值之間有顯著的相關(guān)性（R2=0.998 5）。經(jīng)過(guò)實(shí)際啤酒樣品的檢測(cè)，利用ATP生物發(fā)光法判斷啤酒是否合格的結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法判定結(jié)果一致。

4.6 在面粉中的應(yīng)用

李利霞、伍金娥等[23]優(yōu)化了ATP 生物發(fā)光法，并快速檢測(cè)面粉中的微生物總數(shù)。在所優(yōu)化的方法中，D-熒光素濃度為70 mg /L，熒光素酶濃度為50 mg /L，Mg2+濃度為0. 25 mmol/L。用無(wú)菌生理鹽水將面粉稀釋后，分別用ATP 生物發(fā)光法和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法計(jì)菌落總數(shù)，兩者結(jié)果無(wú)顯著性差異，同時(shí)該法還具有良好的重現(xiàn)性（RSD＝4．0 ％）。實(shí)驗(yàn)證明ATP 生物發(fā)光法可以方便快捷、準(zhǔn)確穩(wěn)定的檢測(cè)出面粉中微生物總數(shù)。

4.7 與**分離技術(shù)結(jié)合的應(yīng)用

目前，國(guó)內(nèi)外研究較多的是**磁分離技術(shù)與ATP 生物發(fā)光技術(shù)（IMS/ATP）兩者結(jié)合檢測(cè)水中微生物的方法。其主要原理是采用目標(biāo)菌抗體包被的磁珠從樣品中將目標(biāo)細(xì)菌分離，然后洗脫并富集目標(biāo)細(xì)菌，*后采用ATP 生物發(fā)光技術(shù)檢測(cè)菌含量。該方法*初由Lee 和Deininger[24]應(yīng)用到檢測(cè)水中的大腸桿菌含量。隨后Bushon 等[25]將該方法做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，采用多克隆抗體技術(shù)并用來(lái)檢測(cè)水中的大腸桿菌和糞腸球菌。該方法既特異性檢測(cè)了目標(biāo)菌，又對(duì)其進(jìn)行了濃縮，提高了檢測(cè)限。Rebecca N. Bushon 等[26]采用該方法檢測(cè)了

廢水中大腸桿菌和糞腸球菌的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IMS/ATP 方法結(jié)果與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)結(jié)果具有較好的線性關(guān)系。Yuxiao Cheng 和Yajun Liu 等[27]在此基礎(chǔ)上研究了生物**納米磁微粒BMNPs （直徑約為20 nm）技術(shù)。該方法關(guān)鍵步驟是構(gòu)建合適的納米**磁微粒，

他們首先將抗生物素蛋白結(jié)合并覆蓋到納米磁微粒表面起到架橋的作用，然后再將生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合到抗生物素蛋白上構(gòu)成BMNPs。與其他方法相比，該方法具有更強(qiáng)的抗原抗體作用力、更多的抗原抗體識(shí)別位點(diǎn)。因此，該方法可以結(jié)合更多的目標(biāo)微生物。結(jié)果表明，在低濃度情況下，BMNPs 可以結(jié)合≥90 %的大腸桿菌，而普通大小的磁珠顆粒僅能結(jié)合大約50%的目標(biāo)菌。同時(shí)該方法的*低檢測(cè)限為20 cfu/mL，作用時(shí)間為1 h，要遠(yuǎn)優(yōu)于其它方法。如噬菌體熒光技術(shù)（FBA）[28] 在原奶中大腸桿菌檢測(cè)限為10 cfu/mL~100 cfu/mL，且需10 h 的富集培養(yǎng)時(shí)間。流式抗體檢測(cè)器技術(shù)[29]的大腸桿菌檢測(cè)限為1.7×105 cfu/mL，需時(shí)間30 min。酶聯(lián)**磁分離—化學(xué)發(fā)光法[30]的大腸桿菌檢測(cè)限為1×105 cfu/mL~1×106 cfu/mL，需時(shí)間1.5 h。

5 結(jié)論與展望

ATP 生物發(fā)光法具有快速、簡(jiǎn)單方便、靈敏度高的特點(diǎn)，與其它的微生物快速檢測(cè)方法相比有著巨大優(yōu)勢(shì)，目前在食品加工行業(yè)中正不斷推廣應(yīng)用。但該方法存在著容易受到外界因素的干擾，不能定性鑒別微生物種類(lèi)，對(duì)于某些樣品的直接檢測(cè)靈敏度仍然達(dá)不到要求的缺點(diǎn)。因此，選取合適的ATP 提取劑，降低外界因素的干擾，增強(qiáng)對(duì)微生物的特異性識(shí)別，提高檢

測(cè)靈敏度成為改善和研究該方法的關(guān)鍵點(diǎn)。目前，新型的ATP 提取劑的研制已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步。同時(shí)，將其它新技術(shù)與ATP 生物發(fā)光法結(jié)合成為一種潮流，例如**磁分離與ATP 生物發(fā)光技術(shù)（IMS/ATP）。IMS/ATP 技術(shù)既降低了外界因素的干擾，對(duì)微生物也具有特異性識(shí)別能力，同時(shí)又極大提高了檢測(cè)靈敏度。但I(xiàn)MS/ATP 技術(shù)也有成本較高，設(shè)備相對(duì)較復(fù)雜的缺點(diǎn)。相信在不久的未來(lái)，隨著科技的不斷發(fā)展，ATP生物發(fā)光法檢測(cè)微生物的技術(shù)一定會(huì)更加成熟和完善，*終將應(yīng)用到更加廣泛的領(lǐng)域。

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