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一般食品微生物檢驗(yàn)方法
內(nèi)容提要
菌落總數(shù)檢測(cè)
大腸菌群及大腸桿菌檢測(cè)
金黃色葡萄球菌檢測(cè)
沙門氏菌檢測(cè)
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)
菌落總數(shù)測(cè)定——菌落總數(shù)的概念
菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。
菌落總數(shù)測(cè)定——衛(wèi)生學(xué)意義
判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。
及時(shí)反映食品加工過(guò)程是否符合
   衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評(píng)
   價(jià)提供依據(jù)。
通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，
   則可考慮致病菌污染的可能性越
   大，菌落總數(shù)的多少在一定程度
   上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。
 FDA BAM 菌落總數(shù)測(cè)定流程
                                            檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）

                                                適當(dāng)十倍稀釋樣品

選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度
各取1mL分別加入**平皿內(nèi)
（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）

     每皿內(nèi)加入適量平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）
                                                                              35 ℃ ，48 ± 2h

菌落計(jì)數(shù)
FDA BAM 菌落計(jì)數(shù)方法
選擇25~250CFU之間的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：
     N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d
所有平板的菌落數(shù)都不足25CFU，報(bào)告EAPC/ml（g）為＜25*1/d。
     EAPC：estimated aerobic plate count
所有平板的菌落數(shù)都超過(guò)250CFU，但不足100/cm2 ，報(bào)告EAPC/ml（g）為*接近250CFU的平板菌落數(shù)的估計(jì)值，乘以相應(yīng)的稀釋度。
所有平板的菌落數(shù)都超過(guò)100/cm2 ，計(jì)算平板的面積（直徑為90mm的平板面積為65cm2），估計(jì)*高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應(yīng)平板面積作為該稀釋度的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，報(bào)告EAPC/ml（g）為＞65*100* 1/d。
無(wú)法計(jì)數(shù)的平板報(bào)告LA（Laboratory Accident）。
*終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進(jìn)偶不進(jìn)。
 ISO4833-2003 菌落總數(shù)測(cè)定流程
                                                檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）

                                                         適當(dāng)十倍稀釋樣品

選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度
各取1mL分別加入**平皿內(nèi)
（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）

     每皿內(nèi)加入適量（12~15mL）
平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA），

                                                                              30±1 ℃ ，72 ±3 h

菌落計(jì)數(shù)
ISO4833-2003菌落計(jì)數(shù)方法
選擇連續(xù)2個(gè)稀釋度不超過(guò)300CFU的平板，且一個(gè)平板至少含15CFU進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：
     N=∑C/（n1+0.1*n2）*d
所有平板的菌落數(shù)都不足15CFU，計(jì)算2平板菌落的算術(shù)平均值m，液體樣品：NE=m
                       固體樣品： NE=m×d-1
無(wú)菌生長(zhǎng)：液體樣品：less than 1;     固體樣品：less than 1 ×d-1
*終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。
菌落總數(shù)測(cè)定幾點(diǎn)說(shuō)明
由于檢樣中采用30/35℃有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實(shí)際的總活菌數(shù)，一些特殊營(yíng)養(yǎng)要求的細(xì)菌、***、微需氧菌、以及非嗜中溫細(xì)菌，均難以反映出來(lái)。
鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來(lái)源于細(xì)胞塊，也可以來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容積或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位（colony forming units，CFU）報(bào)告。
菌落總數(shù)測(cè)定幾點(diǎn)要求
每個(gè)樣品從開始稀釋到傾注*后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不得超過(guò)15min，主要為防止細(xì)菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，避免將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長(zhǎng)時(shí)間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長(zhǎng)。
檢樣過(guò)程中應(yīng)用稀釋劑做空白對(duì)照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時(shí)，檢樣過(guò)程中應(yīng)在工作臺(tái)上打開一塊空白平板計(jì)數(shù)瓊脂，其暴露時(shí)間應(yīng)與檢樣時(shí)間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過(guò)程中有無(wú)受到來(lái)自空氣的污染。
檢樣稀釋液有時(shí)帶有食品顆粒，為避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計(jì)數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4 ℃放置，以便在計(jì)數(shù)檢樣時(shí)用作對(duì)照。
大腸菌群的定義
大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。
大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過(guò)人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。 
大腸桿菌的定義
大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。
大腸桿菌指革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為++--或-+--的細(xì)菌。
與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸**性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。
大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系
衛(wèi)生學(xué)意義
大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。
食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過(guò)污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。
大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。近年來(lái)，有些國(guó)家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染狀況的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。

大腸桿菌的生物學(xué)特性
基本形態(tài)：
    此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。
大腸桿菌的生物學(xué)特性
培養(yǎng)特性：
大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。*適生長(zhǎng)溫度為37℃，在42-44 ℃條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46 ℃。
大腸菌群及大腸桿菌測(cè)定                                ——MPN法檢驗(yàn)流程（FDA BAM）
                                              檢樣50g+450ml稀釋液

                                                適當(dāng)十倍稀釋樣品

選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，
每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管），
每管接種1mL
                                       35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h

         沒(méi)有產(chǎn)氣管                                          有產(chǎn)氣管 

         報(bào)告陰性                                          
                                      接種BGLB肉湯管                                  接種EC肉湯
                      35 ± ℃ ，48 ± 2h                                                                      44.5±0.5 ℃ （水浴培養(yǎng)）
                                                                                                                                24 ± 2h ~48 ± 2h
                                 查MPN表報(bào)告結(jié)果           產(chǎn)氣管接種EMB平板（35℃、18~24h）
                                       （大腸菌群）                       從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜                  
                                                                                      面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接       
                                                                                      種LST復(fù)檢產(chǎn)氣
                                                                                       查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌）                                     
大腸菌群測(cè)定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明
MPN檢索表：
     MPN 為*大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)*近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。
初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：
    1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。
    2）初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。
產(chǎn)氣量與倒管：
    在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。
大腸桿菌測(cè)定——EMB選擇性分離鑒別
EMB平板典型大腸桿
菌菌落特征：
中心黑色或紫紅色，有
或無(wú)綠色金屬光澤
大腸桿菌測(cè)定——EMB選擇性分離鑒別
EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；
高壓**可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；
大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；
該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲(chǔ)存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。
大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色
基本原理：
           革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌兩大類。
           革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。
大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色
大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色
基本步驟：
將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；
滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；
滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；
滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。
結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
大腸桿菌測(cè)定——生化鑒定

金黃色葡萄球菌——概述
根據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，按葡萄球菌的生理化學(xué)組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多為致病性菌，表葡偶爾致病。
金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中*常見的病原菌?？梢鹁植炕撔愿腥荆绨X、癰、皮下膿腫、外科切口及**創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的**和侵襲性酶。 
金黃色葡萄球菌——生物學(xué)特性
金黃色葡萄球菌呈球形，直
徑0.8μm左右，排列成葡萄
串狀 ，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。
金黃色葡萄球菌——生長(zhǎng)特性
金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長(zhǎng)，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈渾濁生長(zhǎng)。
金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——方法適用性
MPN法：適用于檢測(cè)帶有大量競(jìng)爭(zhēng)菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。
直接平板計(jì)數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（ml）的食品。
增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。
金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——直接平板計(jì)數(shù)法
                                       檢樣（50g+450mL稀釋液）

                                         適當(dāng)十倍稀釋樣品

            選擇2~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度
                                            
     吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分別涂布于 
          3塊90mmBaird-Parker平板上（做平行試驗(yàn)）
                                                          35℃ ，45~48 h
                                          確證試驗(yàn)

                                              報(bào)告
FDA BAM 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN法
                                       檢樣（50g+450mL稀釋液）

                                         適當(dāng)十倍稀釋樣品

   選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，
每個(gè)稀釋度接種三管10% NaCl TSB肉湯，
每管接種1mL
                                35℃ ，48 ±2 h
                從生長(zhǎng)的管中接種1環(huán)劃線于 Baird-Parker平板上
                                                            35℃ ，48 h
                                                 確證試驗(yàn)

                                                     報(bào)告
FDA BAM 金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)
1.凝固酶試驗(yàn)
方法：從平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌菌落，移種到TSB/BHI肉湯中，置35℃培養(yǎng)18-24h。取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿充分混合，置35℃培養(yǎng)，定時(shí)觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h。
  試驗(yàn)中需同時(shí)做已知陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
結(jié)果判定：以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)為陽(yáng)性。部分凝固（2+和3+）的必須進(jìn)行生化鑒定加以證實(shí)。
FDA BAM金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)
2.革蘭氏染色
對(duì)所有的可疑培養(yǎng)物都要進(jìn)行革蘭氏染色。
3.生化鑒定
過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)
葡萄糖厭氧利用試驗(yàn)
甘露醇厭氧利用試驗(yàn)
金葡溶菌酶敏感性試驗(yàn)
耐熱核酸酶試驗(yàn)（輔助）
FDA BAM              2種葡萄球菌和微球菌的典型特性
ISO 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)——MPN法
                                       檢樣（xg+9xmL稀釋液）

                                         適當(dāng)十倍稀釋樣品

   選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，
每個(gè)稀釋度接種三管
modified Giolitti and Cantoni broth，
                                37℃ ，24~48 h
                            從變黑或出現(xiàn)黑色沉淀的管中
                      接種1環(huán)培養(yǎng)物于 Baird-Parker平板上
                                                            37℃ ，48 h
                                                 確證試驗(yàn)

                                                     報(bào)告
ISO 金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)
凝固酶試驗(yàn)
結(jié)果判定：
      
          -            1+         2+          3+                4+
沙門氏菌屬簡(jiǎn)介
1880年E. Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌，1885年Salmon與Smith又分離出豬霍亂沙門氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。
沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性、需氧性、無(wú)芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2000多個(gè)血清型，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)血清型近200個(gè)。
沙門氏菌屬——生物學(xué)特性
形態(tài)特征：
     革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無(wú)芽孢，一般無(wú)莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。

培養(yǎng)特性：
沙門氏菌需氧或兼性厭氧，10-42 ℃都可生長(zhǎng)，*適生長(zhǎng)溫度為37℃，*適pH為6.8~7.8。
營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上：35~37℃培養(yǎng)18~24h，其菌落大小一般為2~3mm，光滑、濕潤(rùn)、無(wú)色、半透明、邊緣整齊。
血平板上：中等大小的灰白色菌落。
沙門氏菌屬的抗原
菌體抗原（O抗原）
表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原
鞭毛抗原（H抗原）
纖毛抗原
FDA BAM沙門氏菌檢驗(yàn)流程
前增菌                                     25g樣+225mL乳糖肉湯 （肉制品、肉副產(chǎn)品、動(dòng)物產(chǎn)品）
                                                           勻質(zhì)2min，室溫放置60 ±5min
                                                           混合均勻，測(cè)定調(diào)節(jié)PH6.8 ±0.2
                                                           35℃、24 ± 2h
選擇性增菌                     
                       0.1ml+10mlMM（RV）                            1ml+10mlTTB
                                 42℃、24h
                                （水浴培養(yǎng)）                     35℃、24h                       43℃、24h（水浴培養(yǎng)）
                                                                             含菌量高                         含菌量低
分離培養(yǎng)                       劃線接種 選擇性培養(yǎng)基（BS、XLD、HE）
                                                                       35℃、24~48h（BS）
生化鑒定                   每個(gè)平板挑取至少2個(gè)可疑菌（包括典型和非典型各2個(gè)）
                              接種TSI三糖鐵、LIA賴氨酸鐵高層斜面（LIA高層深4cm）
                                 （松蓋以保持有氧條件防止產(chǎn)生過(guò)多H2S）
                                                                       35℃、24±2h                                                         
                                    棄去                尿素酶試驗(yàn)                 衛(wèi)矛醇、  ***、丙二酸鈉、吲哚試驗(yàn)
                                               陽(yáng)性                              陰性
血清學(xué)                                               血清學(xué)試驗(yàn)——沙門氏菌的分類

                                                             報(bào)告結(jié)果
ISO6579沙門氏菌檢驗(yàn)流程
前增菌                                     25g樣+225mLBPW
                                                           勻質(zhì)
                                                           37±1℃、18 ± 2h

選擇性增菌                     
                       0.1ml+10mlRVS                                      1ml+10mlMKTTn
                                 41.5 ± 1℃、24 ± 3h                                 37 ± 1℃、24 ± 3h
                                （水浴培養(yǎng)）

分離培養(yǎng)        劃線接種選擇性培養(yǎng)基（XLD和**種選擇性培養(yǎng)基，如 BS）
                                                                       37℃、24~48h（BS）
                               每個(gè)平板挑取至少5個(gè)可疑菌進(jìn)行純培養(yǎng)和確認(rèn)試驗(yàn)
                                                                       37℃、24±3h
                                                                      
生化鑒定              TSI、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、β-牛乳糖、V-P、 吲哚試驗(yàn)

血清學(xué)                                          血清學(xué)試驗(yàn)——沙門氏菌的分類

                                                        報(bào)告結(jié)果
ISO6579沙門氏菌生化試驗(yàn)表
沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)
XLD瓊脂：
FDA BAM——典型菌落：粉色菌落，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈
                                              現(xiàn)大的具光澤的黑色中心或幾乎為全部黑色的菌落。
                  ——非典型菌落：黃色帶或不帶黑色中心。
ISO——中心黑色、周圍由于指示劑顏色的改變而出現(xiàn)紅色的輕微透明帶。
沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)
BS瓊脂：
FDA BAM——典型菌落：產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周
                                              圍的培養(yǎng)基通常開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而
                                              變?yōu)楹谏⒂袝灜h(huán)效應(yīng)；
                  ——非典型菌落：有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色菌落，周圍培養(yǎng)
                                                 基不變色。
沙門氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng)
HE瓊脂：
FDA BAM——典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落帶或不帶黑色
                                                    中心或幾乎全黑色。
                  ——非典型菌落：乳糖陽(yáng)性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。
沙門氏菌檢驗(yàn)生化鑒定
TSI：
典型反應(yīng)：斜面產(chǎn)堿（K）：紅色；             底部產(chǎn)酸（A）：黃色；
                    產(chǎn)H2S：黑色（少數(shù)不產(chǎn)）
沙門氏菌檢驗(yàn)——幾點(diǎn)注意
冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動(dòng)調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進(jìn)行15min或在2-8℃，18小時(shí)內(nèi)軟化。
為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的菌落進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定。
進(jìn)行生化反應(yīng)時(shí)，應(yīng)以純培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)，如出現(xiàn)血清學(xué)陽(yáng)性，而生化反應(yīng)特征不符合時(shí)，應(yīng)對(duì)接種物進(jìn)行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進(jìn)行生化試驗(yàn)。
測(cè)試中應(yīng)同時(shí)接種陽(yáng)性對(duì)照菌株。
李斯特菌屬簡(jiǎn)介
《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第9版中，李斯特菌屬有7個(gè)種：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英諾克李斯特氏菌（L. innocua） 、西爾李斯特氏菌（L. seeligeri） 、威爾斯李斯特氏菌（L. welshimeri） 、綿羊李斯特氏菌（L. ivanovvi） 、格氏李斯特氏菌（L. grayi） 、默氏李斯特氏菌（L. murrayi） 。
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起動(dòng)物的感染，也可引起人的感染。
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——生物學(xué)特性
形態(tài)特征：
     革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小為0.4~0.5×0.5~2μm，  兩端鈍圓，常兩兩相串成彎曲及V形，偶爾有球狀、雙球狀、短鏈狀，但很少有長(zhǎng)鏈狀，兼性厭氧、無(wú)芽孢，一般不形成莢膜。該菌有4根周毛和1根端毛，周毛易脫落。20℃培養(yǎng)后可見到很多鞭毛。

培養(yǎng)特性：
生長(zhǎng)溫度為2~42℃（冷藏不能阻止該菌的生長(zhǎng)），*適生長(zhǎng)溫度為35~37℃。20~25 ℃培養(yǎng)有動(dòng)力，37 ℃培養(yǎng)動(dòng)力消失；在顯微鏡下觀察該菌新鮮的室溫肉湯培養(yǎng)物可見翻筋斗運(yùn)動(dòng)。
在pH3.8~4.4仍能生長(zhǎng)，在pH中性至弱堿性（9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長(zhǎng)良好，
      在6.5%NaCl肉湯中也能良好生長(zhǎng)。

血平板上：菌落通常不大呈灰白色，
      刺種血平板可產(chǎn)生窄小的β溶血環(huán)。
FDA BAM單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)流程
                                                                  檢樣25g

增菌                                                      EB增菌液基礎(chǔ)225mL
                                                                          30℃   4h
                                                                    加入抑菌劑                          
                                                      30℃   20h                                         30℃   44h
選擇性分離培養(yǎng)           接種OXA和 PALCAM                      接種OXA和 PALCAM
                                                       35℃   24-48h                                   35℃   24-48h
                                          
生化鑒定                                            TSA-YE純培養(yǎng)
                                                                            30℃   24-48h
                     
                        典型運(yùn)動(dòng)                                                         TSB-YE
                    過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)
                      革蘭氏染色
                        溶血試驗(yàn)   
      
ISO單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)流程
測(cè)試樣品（x g或x mL）
+9x mL一次增菌培養(yǎng)基（Half Fraser肉湯）
                                                                  30℃培養(yǎng)24±2h
1mL培養(yǎng)液加入                                        劃線接種Oxford瓊脂
                10mL二次增菌培養(yǎng)基中                                   和PALCAM瓊脂
                        （Fraser肉湯）
                                  35℃或37℃培養(yǎng)48±2h                                   30℃、35℃或
                  劃線接種Oxford瓊脂                                                       37℃培養(yǎng)24-48h
                      和PALCAM瓊脂
                                  30℃、35℃或37℃培養(yǎng)24-48h
 
                                                     李斯特菌屬的確證：
                                                    -          挑取可疑菌接種TSAYE培養(yǎng)基
                                                    -          過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)
                                                    -          革蘭氏染色
                                                    -          動(dòng)力試驗(yàn)
                                              單核細(xì)胞增生李斯特菌的確證：
                                                   -          溶血試驗(yàn)
                                                   -          碳源利用試驗(yàn)
                                                   -          CAMP（協(xié)同溶血）試驗(yàn)       
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌選擇性分離培養(yǎng)
OXA瓊脂
FDA：灰黑色菌落，周圍有黑色環(huán)。
ISO：生長(zhǎng)在牛津瓊脂上24h的典型李
      斯特氏菌呈?。?mm）、灰色的菌落
      外圍是黑色的暈輪；48h后菌落變暗，可能見到綠色的輝光，直徑約2mm。 有黑色的暈輪并且中間凹陷。
Oxford 瓊脂平板培養(yǎng)于30℃適合于僅受額外菌群輕度污染的食品，對(duì)于受額外菌群重度污染的食品，*好培養(yǎng)于35℃或37℃，因?yàn)槔钏固厥暇呌诤皖~外菌群一同生長(zhǎng)。
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌選擇性分離培養(yǎng)
PALCAM瓊脂
李斯特氏菌屬——動(dòng)力和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)
傘狀動(dòng)力
挑取TSBYE肉湯培養(yǎng)物穿刺接種SIM或半固體動(dòng)力培養(yǎng)基試管，25℃培養(yǎng)5-7d。
李氏菌有動(dòng)力、呈現(xiàn)典型的傘狀生長(zhǎng)。
典型運(yùn)動(dòng)
挑取25℃培養(yǎng)的TSAYE平板上的菌落，
     制備水浸片，顯微鏡下觀察
     李氏菌的翻滾、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。
過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)
李氏菌過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——溶血試驗(yàn)
制備5~7%羊血瓊脂平板。
挑取TSAYE平板上的典型菌落刺種血平板，刺種時(shí)避免接觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時(shí)接種陽(yáng)性（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌）和陰性（英諾克李斯特氏菌）對(duì)照。
單增呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的β-溶血；
西爾李氏菌出現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象；
綿羊李氏菌通常呈寬的、
     輪廓清晰的β-溶血；
英諾克李氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——協(xié)同溶血試驗(yàn)（CAMP）
方法：在羊血瓊脂平板上平行接種β-溶血金黃色葡萄球菌（S.aureus）和馬紅球菌(R.equi),在它們中間垂直劃線接種可疑菌，與兩線相近但不相交，在30℃培養(yǎng)24h-48h,檢查平板中垂直接種點(diǎn)對(duì)溶血環(huán)的影響。
結(jié)果：靠近金黃色葡萄球菌接種點(diǎn)的單增李斯特氏菌的溶血增強(qiáng)，西爾李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng)，綿羊李斯特氏菌在馬紅血球附近的溶血增強(qiáng)。
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌——協(xié)同溶血試驗(yàn)（CAMP）
ISO李斯特氏菌鑒定反應(yīng)
FDA李斯特氏菌屬的區(qū)別
幾種常用稀釋緩沖液介紹
磷酸鹽緩沖液
    儲(chǔ)備液的制備：稱取34g磷酸二氫鉀溶解于500ml蒸餾水中，用1NNaOH
    溶液調(diào)整pH值為7.2，再用蒸餾水稀釋至1000ml，121℃高壓**15min，
    于冰箱中儲(chǔ)存。
    稀釋液的制備：取1.25ml儲(chǔ)備液，用蒸餾水稀釋至1000ml，定量分裝，
    121℃高壓**15min備用。
0.85%生理鹽水
    稱取8.5gNaCl溶解于1000ml蒸餾水中，定量分裝，121℃高壓**
    15min備用。
0.1%蛋白胨水
    稱取1g蛋白胨溶解于1000ml蒸餾水中，定量分裝，121℃高壓**
    15min備用。蛋白胨水對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用，不會(huì)因?yàn)樵谙♂?br>    過(guò)程中使檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。
無(wú)菌水